【案例解析】如何通过原研药物表征，在研发中逆向工程完成药品开发

治疗等效药物：指在相似条件下给药时具有相同的有效性和安全性的药学等效药物。

药学等效药物：含有相同的药物活性成分、剂型、给药途径、规格或浓度的药物制剂。

药学等效不等于治疗等效，因为辅料和/或制备过程中的差异会导致药物性能的差异。药物性能可能在体内或体外环境下存在差异，例如溶出速率和生物利用度。

生物等效药物：在相似试验条件下表现出无显著差异的生物利用度的药学等效药物或药学替代药物。

生物等效性：在一个设计合理的试验研究中，当将两个药学等效药物（或药学替代药物）的药物活性成分（或活性组分）以相同的摩尔剂量给药时，如果两成分在其药物作用部位的吸收速率和吸收程度无显著差异时，则将这两种药物定义为具有生物等效性。

一般情况下，仿制药产品开发从对原研药物或参比制剂的表征开始，随后进行药学等效药物设计，开发有效的生产工艺，并开展关键批生物等效性研究。参比制剂表征的内容可多可少，可以是仅仅对药物释放行为（固体口服制剂）或pH和粘度（液体口服制剂）进行检测，也可以是对处方组成进行全面的定量剖析。对参比制剂进行系统、科学的评价，可以得到这些信息。这个过程也被定义为反向工程研究。虽然很多时候仿制药公司都依赖于对原研药物进行表征，但是文献中很少提到这一主题。本章重点从处方和监管的角度总结仿制药开发过程中的原研药物表征。

图1  仿制药制剂开发路径图

系统开展的原研药物表征有利于仿制药开发各阶段的决策（图1）。在第一阶段，API固体形式的信息利于识别有价值的技术参数、选择合适的供应商。类似地，为了开发出定性和定量方面均与参比制剂相似的仿制药，需要有一个高度精炼的处方前研究方案。

处方研究的第二阶段将从原研药物表征中得到最关键的信息。关键辅料的定量信息将简化制剂处方优化的工作。传统的处方开发工作包括设计几个处方并考察不同处方的性能和稳定性。解析原研药物的定量信息，可以减少得到最佳处方的实验数量。在质量源于设计（QbD）概念下，原研药物的定量信息有助于识别药物的关键质量属性，从而进行更有效的实验设计。此时的决策对溶出情况等实验结果的依赖性降低，因此决策过程将更客观；溶出情况等实验结果虽然是一个有效的工具，但不能确保一定能开发生物等效的产品。通过原研药物表征，开发出定量方面与参比制剂相似的药物，并保证其与参比制剂溶出行为的相似性，将更容易实现仿制药与参比制剂的生物等效。同样地，对参比制剂中的API进行固态表征，可以降低开发过程中的风险，尤其对于溶出情况决定生物利用度的药物。

参比制剂的定性处方组成可以从公开资料中获得。原研公司提交的“批准基础概要”公开部分，是仿制药公司的一个很好的信息来源。这些信息可以在美国FDA网站的“Drug@FDA”板块查阅。一些常规的资料，像产品信息手册和医师案头手册，也包含有用的信息。

参比制剂处方组成的定量解析可以进一步细分为两个步骤：1. 关键辅料的识别；2. 对识别出来的辅料进行定量检测。

参比制剂处方组成的定量解析，应该从识别对药物产品稳定性和性能具有显著影响的辅料开始。这些辅料被称为关键辅料。关键辅料包括BCS II类或BCS IV类药物的增溶剂和溶出调节剂，疏水性药物的润湿剂，pH敏感药物的pH调节剂/缓冲剂，易氧化降解药物制剂中的稳定性/抗氧剂。文献报道，山梨醇、甘露醇、甘油和PEGs等一些特定辅料可以通过影响溶解性、溶出速率或渗透性来影响药物的生物利用度。这个过程为后续的原研药物表征提供信息，有助于评估反向工程研究的优势，因为有时传统的处方优化技术可能比反向工程研究更有效。通常，pH调节剂、缓冲剂、稳定剂（例如抗氧剂和螯合剂）、溶出调节剂（例如表面活性剂，控制释放速率的聚合物）最适用于反向工程研究。

下一步是对固体制剂中的关键辅料进行定量检测，因为制剂中的其他辅料可能会对检测过程有干扰，所以该过程的难度较大。辅料的定量检测涉及两个步骤，即辅料的分离/萃取和辅料的定量检测。以下技术可将辅料从片剂基质中分离出来：溶解度的差异，过滤（使用特定孔径或截留分子量的滤器），高效液相色谱（HPLC），高效薄层色谱（HPTLC），分子排阻色谱。需要结合体系中干扰成分的数量和及其理化性质来选择合适的分离技术。

辅料分离以后，可以采用重量法或各种检测工具进行检测，检测工具包括紫外-可见光、折光率、蒸发光散射检测器（ELSD，HPLC）、光谱技术（例如红外（衰减、透光率、反射系数）或近红外光谱）。重量法最适用于制剂中用量较大的主要辅料的定量检测。稳定剂、表面活性剂和pH调节剂等用量较小的辅料最适用于复杂的分离和定量技术，例如HPLC和HPTLC。聚合物等高分子量辅料可以采用分子排阻色潽法进行有效检测。

其他有用的技术包括气相色谱、液相-质谱、胶束电动毛细管色谱、比色法、电位测定法、变角衰减全反射傅立叶变换红外光谱、核磁共振、毛细管电泳。检测过程需要注意消除假阳性和假阴性结果。针对制剂中其他辅料可能存在的干扰，检测方法必须进行验证。最近，检测仪器领域有了一些新的进展，例如，马尔文的SyNIRgi近红外化学成像系统宣称可以检测制剂中每一种辅料的用量。

图2  不同水平的固态性质及其重要性

对制剂产品中API的粒径检测的挑战是，在其他辅料存在的情况下检测API颗粒粒径。基于遮光和激光散射的常规颗粒粒径检测技术不适用，因为这些技术不能区分API和辅料。唯一可行的技术是显微镜检查。

基于颗粒形状和双折射模式等特征，显微镜检查可区分API和辅料。在偏振光下，晶型药物表现出双折射特性，而大部分辅料是非晶态的、不表现出双折射特性。基于熔点的差异，热台显微镜可识别API。因此，从分子和颗粒水平对API进行识别并表征，可以加快制剂开发过程中的决策。虽然没有相关的报道，采用光谱成像技术检测颗粒粒径分布在理论上是可能的。

图3  药片在水中2 min、10 min时崩解方式的显微照片（使用光学显微镜观察，400×）。a：制粒工艺；b：直接压片

3.      辅料晶型的复杂性（例如，制剂中含有一些晶型/非晶型辅料）

4.      API的固态形式转变（例如，API是亚稳态晶型，工艺过程/溶剂/温度可能导致其晶型发生转变）

5.      API和辅料的双折射性质、熔点、溶解度等理化性质及其相似

6.      复方制剂

图4  片剂反向工程研究的决策树

案例1：盐酸雷尼替丁片的反向工程研究

盐酸雷尼替丁属于BCS III类药物。但是，基于该药物的治疗效果和治疗指数、药代动力学性质和辅料相互作用可能性的数据，盐酸雷尼替丁速释固体口服制剂有可能被豁免BE。因此，盐酸雷尼替丁是进行反向工程研究的一个很好案例，以便实现处方定量组成的相似性。通过四个步骤进行原研药物表征，分别是：(i)文献调研；(ii)处方组成的定量检测；(iii)制备工艺的识别；(iv)API的固态表征。

图5  盐酸雷尼替丁片处方组成的定量检测

步骤一：文献调研

文献分析得到的信息显示，Zantac® 75 mg片是薄膜包衣片，所含辅料有微晶纤维素（MCC）、羟丙甲纤维素（HPMC）、硬脂酸镁、二氧化钛、甘油醋酸酯、合成氧化铁，主药为84 mg盐酸雷尼替丁（相当于75 mg雷尼替丁）。选择MCC、HPMC、硬脂酸镁进行反向工程研究。

步骤二：处方组成定量检测

采用溶解度差异、重量法和FTIR进行处方组成的定量检测，如图5所示。反向工程研究有助于获得片芯的定量组成信息，盐酸雷尼替丁含量为84 mg，MCC含量为61 mg。硬脂酸镁是非关键辅料，可以在工艺研究时进行优化。片芯中不含HPMC。

步骤三：制备工艺的识别

通过微观评价崩解方式，进行制备工艺的识别。崩解以后，出现颗粒，表明片剂制备采用了制粒工艺（图6）。

步骤四：片剂中API的固态表征

使用热台显微镜检测原料药的粒径，结果表明粒径分布范围为2-33 μm，其中大量（43%）的原料药粒径分布在10-15 μm。使用显微镜、FTIR、PXRD技术检测原料药晶型，结果表明原料药晶型为II型。

图6  原研片在水中2 min（a）、10 min（b）时崩解方式的显微照片（光学显微镜，400×）

图7  （a）药片粉末分布在油中，环境温度下，可见光下的显微照片；（b）样品在热台上加热至195℃，圆圈所示为原料药的熔融液滴。放大倍数：500×。注意：a和b所示不是同一个区域。

案例2：片剂中原料药颗粒粒径的检测

本案例是检测Levitra®片（盐酸伐地那非）中的原料药颗粒粒径。盐酸伐地那非是晶体粉末，水中溶解度为0.11 mg/ml，熔点为192-194℃。从标签信息中获悉的片芯辅料成分为：API、微晶纤维素、交联聚维酮、胶体二氧化硅、硬脂酸镁。原料药的熔点与其他所有成分都不同。因此，可以采用热台显微镜检测片剂中原料药的颗粒粒径。使用配备了成像系统（DC-300，徕卡，德国）的光学显微镜（莱卡DMLP，莱卡，德国）进行检测，在可见光和偏振光模式下，利用Image Manager软件，用预先校准的镜台测微尺测量原料药的颗粒粒径。光学显微镜上连接有热台（莱卡LMW 50），用于观察样品的受热变化，确认药物颗粒。首先，使用锋利的手术刀片剥去药片的包衣层，取部分片芯放置于两个玻璃片之间，轻压，将粉末安置在显微镜上。将样品加热至原料药熔点以上10℃左右（图7所示为原料药溶化前后的显微照片）。识别原料药颗粒之后，即可对其进行粒径测量（图8）。

图8  柱状图表示Levitra®片中原料药的颗粒粒径分布

依据，口服溶液剂（酏剂、糖浆剂、酊剂）、注射剂（IV-静脉、IM-肌肉、SC-皮下）和其他局部用溶液剂的体内生物利用度合格，可以BE豁免。其前提是溶液剂中不含有显著影响药物吸收的辅料，且药物制剂中的药物释放是没问题的。只要生物利用度未改变，缓冲剂、防腐剂和抗氧剂允许存在差异。但是，溶液的pH需要和参比制剂保持一致。因此，对于溶液剂而言，对其处方组成进行定量检测确实是一种性价比高、节省时间的方法。