来源：研如玉
编者语：我们曾经推送过很多国家地区关于生物等效性的文章如：
USP39-NF34 体内生物等效性试验指南
【文献翻译】日本口服固体制剂生物等效性研究的监管考虑（第一部分）
【文献翻译】日本口服固体制剂生物等效性研究的监管考虑(第二部分
【大力推荐】欧洲药品管理局关于产品特定生物等效性研发指南的概述
今天我们为同行推送欧盟生物等效要求：批判性讨论（题目复制粘贴错）的翻译与同行共享
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欧盟的生物等效性要求：关键性溶出
摘要：本文旨对修订后的欧盟（EU）生物等效性研究指导原则进行总结，并就之前的欧洲要求和当前的美国食品药品监督管理局指导原则进行批判性讨论，其更相关的创新之处如下：为了促进仿制药品的开发，欧盟指导原则包括基于生物药剂学分类系统（BCS）的生物豁免资格，不仅适用于BCS I类药物，也适用于对溶出度和辅料组成要求更严格的III类药物。根据生物药剂学药物处置分类系统，已将BCS分类的渗透性标准替换为人体可吸收性。只有针对高度变异的参比制剂，并有额外的临床理由，才有可能扩宽Cmax的接受范围。以0.760的比例常数进行标度拓宽，这比FDA的方法更为保守，当个体内CV接近30%时，由于标度和恒定标准之间的平滑过渡，消费者风险保持在5%的水平。该指导原则同意进行两阶段设计作为正式生物等效性研究的一部分，从中期分析中获得有关制剂差异和变异性的必要信息，而不是进行预试验。该指导原则还规定，在进行统计分析时，应将所有因素视为固定因素，这对重复设计有影响。尽管自20世纪90年代初以来，生物等效性（BE）原则早已明确规定（即，在对相关药代动力学参数—Cmax和曲线下面积（AUC）进行对数转换后，受试和参比最小均方均值之比的90%置信区间的20%可接受范围（80–125%）），但关于生物等效性研究的设计、实施以及评估要求的许多细节，国际上没有达成共识，因为它从来都不是国际协调会议的主题。因此，每个监管区域，如美国（1-3）、日本（4）、欧盟（5,6）、加拿大（7-10）和南非（11），都发布了自己的相应指导原则。1992年6月，欧盟发布了第一份BE指导原则《生物利用度和生物等效性研究》，作为欧洲共同体药品管理规则的一部分。该指导原则被修订为《生物利用度和生物等效性研究指导原则备注》，于2001年7月发布（12）。随后，通过问答文件对具体主题进行了澄清（13）。自2007年5月起，疗效工作组的药代动力学小组（现为药代动力学工作组）对该指导原则进行了全球更新，人用药品委员会（CHMP）于2010年1月将其采纳为《生物等效性研究指导原则》（自2010年8月1日起生效）（5）。这一更新是必要的，一方面是为了澄清要求，目的是提高欧盟不同成员国内部的同质性，从而减少对互认和非集中程序的协调小组（人用）（CMD（h））和CHMP的分歧和仲裁，另一方面是为了考虑BE领域的科学进展，例如，基于生物药剂学分类系统的高变异性药物和生物豁免要求。本文对修订后的《欧盟生物等效性研究指导原则》进行了总结和批判性讨论，尽管其包含适用于任何剂型BE研究的一般原则，并在附录II中规定了其他几种剂型的要求，但据说其内容仅限于具有全身作用的常释剂型。调释产品的具体BE要求在不同的指导原则（5）中有规定，该指导原则目前正在审核。对于欧盟以外的国家，重要的是首先了解指令2001/83（14）中规定的仿制药概念，这与美国食品药品监督管理局（US-FDA）的仿制药概念不同。在欧盟，通过药效动力学或拥有临床终点的治疗等效性试验来显示等效性的产品，即局部作用和局部应用的产品，如吸入、鼻腔、皮肤、胃肠道、眼科产品等，不被视为仿制药，而是混合物。仿制药仅指通过生物利用度研究（即药代动力学研究）证明其BE的那些药物。此外，对于常释口服剂型，不同剂型之间的BE是可以接受的，即口服液和片剂。此外，除非诸如活性物质的不同盐、酯、醚、异构体、异构体混合物、络合物或衍生物等药物替代品在安全性和/或有效性方面存在显著差异，否则都将其视为相同的活性物质。若是认为仿制药可以与参比至今进行互换，那么其中一些差异（如果不是全部的话）就有些难以理解。制定此类标准的原因是，在欧盟，药品立法仅涉及药品的可批准性或可处方性。如果收益–风险关系为正，则产品被批准，但这并不意味着它可以与参比制剂互换。替代政策是一个不受欧盟监管的全国性问题。对于欧盟以外的国家来说，另一个可能难以理解的问题是，在生物利用度（药代动力学）对比研究中未能显示BE的产品可以根据显示等效性的药效学/临床研究获得批准，即使这些研究对检测产品之间的差异不太敏感。同样，这是因为在欧盟，目标不是交换这些混合产品，而是基于积极的利益–风险关系批准它们。欧盟要求的BE研究数量必须根据物质的理化特性（例如，溶解度和手性）、药代动力学特性（例如，线性或剂量比例、产品特性总结（SPC）中的食物效应/食物摄入量建议）、成分的比例（成比例的规格的豁免研究）来进行推断。目前，欧洲药品管理局（EMA）并未发布类似于FDA网页（15）上提出的“特定产品生物等效性建议”的BE建议，这尤其简化了制药行业仿制药的开发。与过去的做法不同，修订后的指导原则要求提交用申请中所提议的制剂（即相同的成分和生产工艺）与在欧盟上市的参比药品所进行的所有研究（仅用于预试验的概要）。此外，应提交制剂开发期间所进行的研究的概要。与先前指南相比，修订版中唯一的试验设计变化是，对于具有非线性药代动力学（PK；剂量或时间依赖性PK）的常释产品，无需进行额外的多剂量研究。与美国食品药品监督管理局（US-FDA）指导原则相比，试验设计方面似乎没有重大差异，因为两个地区都推荐采用标准单剂量2 × 2设计。显然，如果两个治疗组中可能影响药物PK的人口统计学特征（如年龄、体重、性别、种族、吸烟状况和代谢状况）具有可比性，则平行设计对于半衰期很长的药物是可以接受的。因此，在平行设计中，表型和/或基因分型是必要的。此外，为了评估参比制剂个体内的变异性，建议对高变异性药物进行重复设计，目的是扩大Cmax的接受限度（16）。只有当单剂量研究因以下原因不可行时，才可接受多剂量研究：（1）出于耐受性/安全性问题，要求在没有被动冲洗期的患者中进行研究，或（2）在分析灵敏度低的特殊情况下，无法估计单次给药的血药浓度–时间曲线，但能够检测到稳态蓄积后出现的较高血药浓度。由于多次给药后的Cmax比单次给药后的Cmax对检测制剂差异的敏感性低（17，18），因此如果既没有溶解度限制，也没有耐受性限制，则优先使用单次超治疗剂量进行研究。尽管2001/83（14）指令中对参比药品的定义明确规定，“参比药品”应指根据第6条授权的药品，但已根据第8条规定《申请人须知》（19）和《生物等效性研究指导原则》（5）拓宽了参比制剂可以具有的法律依据。现在，不仅仅是基于第8（3）条申请的产品，那些基于2001/83/EC指令第10a、10b或10c条申请的产品也可被视为合适的参比制剂。由于参比制剂必须是基于完整的档案资料（第8（3）条），因此当原研药不再上市销售时，可以使用原研药的许可证（第10c条）作为参考，或者固定剂量组合（第10b条）是该组合的完整档案资料时，这是可以理解的。但是，将主要以文献数据加上一项或仅有的几项临床研究为基础的申请视为混合档案（是完整档案的一种类型（第8（3）条）），因为将创新者的仿制药与混合档案的仿制药混淆在了一起，所以此类申请是一种更具争议的参比制剂。从科学的角度来看，很明显，那些仅仅因为已经在欧盟上市而被认为具有成熟用途的药物的书目申请（第10a条）显然不应该被认为是合适的参比制剂，因为这些产品是根据使用其他产品获得的文献数据而获得的批准，在大多数情况下，并没用根据第10a条对制剂进行过试验。因此，在进入欧盟市场之前，通常没有对这些产品进行BE或对比性生物利用度研究，只是将拟议产品的生物利用度与文献中描述的产品（具有良好的用途）联系起来。在美国，要了解如何对一个缺乏临床前和临床数据的产品授予上市许可，一定是一项挑战。事实上，那些认为新产品的生物利用度不会发生显著变化，并且收益–风险关系同样为正的欧盟立法者在某些情况下可能是错误的，例如，在根据书目申请获批的产品中使用少量的十二烷基硫酸钠（SLS），阿仑膦酸盐的生物利用度将提高五到六倍（未公布的数据）。如果书目产品应该上市是有疑问的，那么此类产品的仿制药不应该被接受是很容易理解的。最后，虽然脂质体被认为不符合欧盟对仿制药的定义，因为除了生物等效性药代动力学研究外，可能还需要进行临床和/或临床前研究，但EMA已将参考已批准为混合申请（原EEC指令65/65的第4.8（a）（iii）条）的产品（Caelyx®2 mg/ml输液浓缩液）的申请确认为仿制药/混合药品（Doxorubicin Sun）（20）（21）。含有脂质体阿霉素的参比制剂被认为是参照常规阿霉素参比制剂的一种混合申请（22）。虽然一个简略申请不能参照另一个简略申请，但在这种情况下，仿制药申请是同时参照脂质体产品（混合型）和常规静脉注射液（完整档案）。除此之外，欧盟指南要求与可用的参比制剂的相同剂型进行比较是合理的。当创新者公司开发生产线延伸时，建议将新剂型与最接近III期试验所用剂型进行比较。最后，根据修订后的指南，申请人应证明所研究的参比制剂批次能够代表市场上的参比制剂，并与欧盟市场上的至少两个批次进行比较。如其他类似指南所示，为了确保估计可靠，受试者的最低人数规定为12名。有趣的是，该指南强调健康志愿者模型在大多数情况下足以将结果外推到其他人群，但没有规定外推不充分的罕见情况。因此，除非在文献中发现了这些罕见的情况，否则就必须假设健康志愿者的模型始终适用。为了减少变异性并增加证明BE的可能性，研究条件的标准化应符合申办方的利益。在修订后的指南中，夜间禁食时间已减少至至少8小时，并且治疗时需摄入的液体量至少为150毫升。当一项研究要在餐后状态进行时，修订后的指南表明，进食的时间必须遵循参比产品的SPC。如果SPC中未详细提供此信息，则应在餐后30分钟内给药，食物并应在30分钟内食用。该指南指出，尽管应避免同时服用药物，但允许使用避孕药，因为任何其他被认为是治疗紧急问题所必需的药物都是如此，但是，必须报告这些药物的使用情况，并且必须证明它们既不会对分析产生干扰，也不会在药效上相互作用。对于那些总是与另一种药物联合服用的药物（例如，用利托那韦增强药效的药物），研究可以联合或单独进行，由于两种产品的相互作用程度是相同的，所以其中一种情况下的BE表明另一种情况下的BE。关于BE研究期间的食物管理，修订后的欧盟指导原则仍与美国FDA法规不同。美国食品药品监督管理局（1）的方法是，为了证明BE，除了空腹研究外，还需要在餐后条件下进行研究，但以下情况除外：（1）I类药物，当受试产品和参比制剂（RLD）都快速溶解且具有相似的溶出曲线时，（2）当RLD的SPC规定产品只能空腹服用时，或（3）当RLD标签未说明食物对吸收或给药的影响时。相比之下，在欧盟（5），假设空腹状态是检测配方差异最敏感的条件，则一般只需要在空腹状态下进行一项研究。因此，食物效应可能存在，但我们不认为采用常规制药技术生产的产品在空腹状态下是等效的，在餐后状态下就是生物不等效的，因为空腹状态是更具区分力的。因此，人们认为增加此类产品的监管负担是没有必要的。根据这一原则，对于只在空腹状态下服用或不考虑食物的药物，该药物的BE研究必须在空腹状态下进行。然而，在其标签中建议参比制剂仅在餐后状态服用的情况下，该产品的BE研究一般应在餐后状态下进行。这“一般”是指，如果SPC中建议采用空腹状态是为了避免与患者长期服用相关的耐受性问题，则在健康志愿者中进行单剂量空腹状态研究是可以接受的，但如果由于药代动力学原因导致全身暴露明显不同需要采用餐后状态，则应在餐后状态下进行研究。对于采用特殊（非常规）技术（如微乳和固体分散体）的产品（受试或参比），这种方法有一个例外，这些产品可以在不考虑食物的情况下服用，因为这些产品必须在空腹和餐后状态下显示BE（如环孢素微乳剂）。如美国许多常规产品所要求的那样，在空腹状态和餐后状态下用高脂肪、高热量的膳食测试产品的性能，其优势在于测试了食物效应的极端情况，并且可以假设BE与中间膳食的关系。在欧盟，如果参比制剂的SPC表明药物要与食物一起服用，但没有就膳食成分提出具体建议，则研究应采用高脂肪、高热量的膳食，因此，没有研究当产品与具有不同更温和成分的膳食一起服用时的生物等效性，这样可能更现实。在空腹状态下和高脂肪高热量膳食后证明生物等效性将代表一种括号法，其中可以假设所有中间膳食成分。相比之下，在高脂肪高热量膳食的最坏情况下证明生物等效性不能被视为代表所有可能的膳食组成。高脂肪、高热量的膳食可能是一些欧洲国家的晚餐或午餐的代表，但通常不会被认为是典型的早餐。另一个有争议的问题是高脂肪、高热量膳食的组成。在美国食品药品监督管理局（US-FDA）中，高脂肪、高热量膳食是有规定的，例如，一个示例性受试膳食是两个黄油煎的鸡蛋、两条培根、两片黄油吐司、四盎司的土豆泥和八盎司的全脂牛奶。只要该膳食从蛋白质、碳水化合物和脂肪中提供了类似的热量，并且具有相当量的膳食体积和粘度，就可以在这顿受试膳食中进行替代。然而，在欧盟，只规定了膳食中每种成分的热量，这就为根据研究地点的饮食习惯采用不同类型的食物留出了空间。因此，膳食的体积、质地和粘度可能会有很大差异，这可能会影响食物效应的作用程度。在单剂量研究中，应使用非房室方法来估计常规PK参数，例如AUC(0-t)、AUC(0-∞)、残留面积、Cmax、tmax、λz和t1/2。单剂量研究中需要统计分析的参数是Cmax和AUC(0-t)，而不是AUC(0-∞)。BE研究首次采用72小时截断的AUC（AUC(0-72)）代替AUC(0-t)（23）。对于稳态下进行的研究，常释剂型的统计分析参数为Cmax,ss和AUC(0-t)。如果使用尿液数据，若血浆中无法检测到Cmax，应测量Ae(0-t)和Rmax。只有当母体药物无法在血浆中测量时，并且可以证明尿液排泄反映了血浆暴露，尿液数据才是可接受的。但是，该指导原则在可能的方法中并未指出优先选择：血浆中母体药物的稳态后研究、血浆中代谢物的单剂量研究或尿液中母体药物的单剂量研究。这是一个具体问题具体分析的决定。有趣的是，如果是多剂量研究，在首次给药后，即使可以测量，也不需要测量血浆中母体的Cmax；而对于尿液中母体药物的单剂量，如果可以测量，则应使用血浆中的Cmax代替Rmax。原则上，即使母体药物是非活性状态，也必须进行测量，因为其Cmax在释放率方面对检测配方差异具有更高的灵敏性（18，24，25）。然而，在前药或对活性贡献很低的药物的情况下，由于与血浆水平很快消失相关的高变异性，所以BE很难显示，出于实际原因，仅测量主要活性代谢物是可以接受的（例如，霉酚酸酯与氯沙坦）（26）。不鼓励使用代谢物作为活性母体药物的替代物。只有在最先进的分析技术无法测量母体药物单次给药后的低浓度时，才会考虑这种情况。在这种情况下，有必要证明由于耐受性/安全性原因或溶解度限制，超治疗剂量是不可行的，并且在治疗剂量下，代谢物的形成没有达到饱和，因此代谢物暴露量反映了母体暴露量。如果对母体药物进行测量，即使PK系统是非线性的，也不需要对活性代谢物进行测量。尽管有经验表明某些他汀类药物在母体和代谢物之间的结果不一致，但是由于这些都是非常特殊的情况，因此风险被认为很小。相反，对于由肠壁或其他体前代谢形成的活性代谢物，美国食品药品监督管理局建议对代谢物和母体药物都进行测量，但只需使用置信区间法对母体药物进行分析。代谢物数据可用作对比治疗结果的支持性证据，并可突出代谢物暴露存在的显著差异。这种方法似乎更适合于他汀类药物的评估，但对大多数药物来说是不必要的。此外，由于缺乏正式的统计分析，使得数据很难解释。修订后的指导原则就对映体药物手性生物分析方法的需求提出了新的建议。当满足（或未知）三个条件时，手性方法是必要的：（1）对映体表现出不同的药代动力学，（2）对映体表现出明显的药效学差异，（3）对映体之间的暴露（AUC）比率因吸收率的不同而改变。与美国食品药品监督管理局（US-FDA）的要求相反，次要对映体不一定具有主要疗效和安全活性，因为即使优映体和劣映体具有相似的暴露量，非手性方法的偏差仍然存在（27）。此外，当对映体之间的AUC比率因吸收率的差异而改变时，在已知的吸收率下，两种对映体可能表现出相似的PK，但在另一个吸收率下，PK会有所不同（28）。因此，如果第三个要求得到了满足，那么第一个要求就得到了满足。因此，只有在能够证明对映体具有相似的药效学活性（例如，奥美拉唑）或两种对映体均不存在非线性吸收（表现为对映体浓度比随药物输入速率的变化而变化）时，非手性方法才是可以接受的。有趣的是，美国食品药品监督管理局比较了随时间变化的对映体浓度比，而欧盟为了简单起见，比较的是AUC，但似乎不太准确。不巧的是，根据修订后的EMA指导原则，虽然依托度酸的例子说明了非线性吸收，但手性生物分析方法对于依托度酸来说是不必需的，因为它只影响Cmax（29）。虽然指导原则中没有指出，但可以推断出，对于存在对映体相互转化且相互转化取决于吸收速率的纯对映体药物，手性生物分析方法是必要的。在内源性物质的BE研究中，应当将可能影响基线水平的饮食摄入等因素标准化，并应使用基线校正来计算药代动力学参数。如果耐受性良好且无溶解度限制，则超治疗剂量有助于测量治疗所提供的基线以上的浓度。基线校正的类型必须根据物质的特性逐一预先确定。在某些情况下，该方法将涉及减去一个恒定的基线水平，该基线水平可以是每个受试者的几个给药前浓度的平均值，或者在内源性水平不恒定时减去每个受试者的给药前AUC。然而，这两种情况并未解决内源性物质外源性给药后可能出现的反馈机制。因此，申办者应证明拟申请的基线校正策略的充分性。在内源性水平相对于外源性水平可忽略不计的罕见情况下，无需进行基线校正（例如，超治疗剂量或无内源性值或内源性值非常低的患者）（30）。有趣的是，该指导原则明确指出，如果之前未确定这一点，则必须在预试验中或作为BE研究的一部分使用不同剂量的参比制剂，通过证明不同剂量给药后的暴露分离来确保研究的敏感性。如果一项申请包含多个规格，并且这些规格满足某些标准，那么只需证明一种或两种规格的BE即可。豁免某些规格BE研究的标准如下：a.药品通过相同的生产工艺获得。应该注意的是，现在可以在不同的生产厂生产它们。b.虽然某些辅料（如着色剂）可能不同，但不同规格的定性成分是相同的。c.不同规格的组成在数量上是成比例的，即所有规格中每种辅料的量与活性物质的量之间的比例都是相同的。对于常释产品，包衣成分、胶囊壳、着色剂和香精无需遵守此规则。此外，在BE研究中使用的规格和豁免的规格中，当活性物质的量小于片芯重量或胶囊内容物重量的5%，并且以下条件之一适用时，则完全成比例的成分有一些偏差是可以接受的： 1.不同辅料的量是相同的，且只有活性物质的量发生了改变，或 2.改变填充剂的量来补充活性物质量的变化，其他辅料的量保持不变。d.适当的体外溶出数据应证实溶出曲线的相似性，以及e.已在反应最灵敏的规格下对BE进行了研究，目的是检测产品之间的潜在差异。待测规格取决于药代动力学线性，更具体地说是取决于AUC剂量比例。值得注意的是，尽管Cmax在检测溶解度限制吸收（如格列美脲）方面通常比AUC更灵敏，但由于Cmax的变异性较高，这可能会使PK线性/剂量比例的结论更加困难，所以不考虑它，本指导原则中包含了一个简单的AUC剂量均衡标准，仅用于此目的：在所研究的规格和待豁免规格之间，剂量调整后的平均AUC差异不得超过25%（即，比值在0.75和1.33之间）。对于线性PK药物，仅用一种规格建立BE就足够了，通常为最高规格，但如果药物是高溶解性的，则任何较低的规格都是可以接受的。在任何情况下，出于耐受性或安全性的原因，则任何较低规格的研究都是可以接受的。相反，如果在该剂量下既不存在耐受性问题，也不存在吸收/溶解度限制，出于分析原因，则最好使用最高规格多个单位的超治疗剂量也是可以接受的。在非线性PK的情况下，随着剂量的增加，AUC增幅超过正比，则BE研究应在AUC与剂量曲线的曲线部分所对应的规格下进行，这通常是最高规格。在PK为非线性的情况下，随着剂量的增加，AUC的增加不成正比，确定非线性的原因是必须的。在转运蛋白（例如加巴喷丁）饱和的情况下，应测试AUC与剂量曲线的线性部分中的最低规格或任何规格，因为在最高规格时，曲线是平坦且不敏感的。相反，如果是由溶解度/溶出度限制引起的非线性，则应研究最低和最高规格。如果两种制剂都表现出相似的非线性，则最低规格（或AUC与剂量曲线线性部分所对应的任何规格）将是最敏感的，但如果新制剂能够避免溶解度/溶出度限制，或者在极端情况下表现出剂量均衡，那么最高规格将是最敏感的。出于安全性/耐受性或生物分析灵敏性低的原因，具有线性药代动力学的药物可如上述所述调整剂量。此外，该指导原则现在包括括号法，当制剂在某些规格（如，制剂的组成在数量上不成比例且溶出曲线不相似）上不满足豁免BE研究的标准时，仅对两个规格进行研究（极端情况）。有趣的是，当需要研究两种规格，且需要进行餐后和空腹研究时，只在餐后和空腹状态对一种规格进行评估可能就已足够。豁免另一种规格的空腹或餐后研究必须基于以前的知识或在空腹和餐后状态下测试该规格时获得的信息，以此来选择最敏感的条件（餐后或空腹）。这是有争议的，因为申请人需要证明哪项研究可以豁免，并且在评估期间可能难以达成一致（例如，西罗莫司常释产品，因为不同规格的参比制剂在相同的剂量水平下进行测试时是生物不等效的）。如果是固定组合，应满足所有活性物质的组成比例要求，与此同时在考虑每种原料药的用量时，可以将其他活性物质视为辅料。如果是双层片，可以单独考虑每一层。值得注意的是，该指导原则仅提及了规格，并未解决当单次剂量高于最大规格时可能需要对单次剂量给药进行测试的问题，例如，对于低溶解度药物来说，可能只能在最高给药剂量下才能检测到差异，因为低溶解度在最大规格下可能并不是关键。只有当受试产品之间的效价差异大于5%时，才能接受效价校正。只有当在欧洲市场上找不到与受试制剂批次的效价差低于5%的参比制剂批次时，偏差大于5%才是可接受的。该策略应根据两种产品的分析报告在研究方案中预先明确规定。该指导原则规定，交叉试验（或平行研究中的一个周期）中未同时提供受试和参比制剂数据的受试者不应包括在统计分析中。因此，根据其他受试者的观察结果来估算缺失的观察结果的统计方法的使用是不可接受的。应排除与相关对比无关的治疗数据，例如，来自欧盟以外的参考文献数据或当分别在空腹和餐后状态下进行BE研究时，4个周期研究中的餐后/空腹组。否则，所有接受治疗的受试者都应纳入统计分析。事实上，接受治疗但仅在其他受试者退出时才对其样本进行分析的“备用受试者”是不可接受的，即使没有退出试验的情况，也应对所有接受治疗的受试者进行分析。该指导原则强调，必须在分析他/她的样本之前做出撤回受试者的决定。如果方案中预先规定了撤回原因（例如呕吐、腹泻、需要同时服用药物），则撤回原因是可以接受的，但不接受基于统计分析（即异常值）或药代动力学原因（例如，不可信的值、AUC的外推大于20%）的撤回。然而，正如美国食品药品监督管理局（US-FDA）指南中所述，具有显著给药前水平（大于Cmax的5%）的受试者应排除在外，因为这种遗留效应可能在序列之间是不同的，并会使BE的点估值发生偏差。有趣的是，指导原则中还包括了排除“a”受试者的另一个原因，但不清楚它是否仅指一个特殊案例，或者是否可以接受更多的案例（例如，两个或三个），以及需要多少案例才能得出研究有效性有问题的结论。根据该指导原则，如果受试者没有表现出任何水平或水平不显著（小于其他受试者几何平均值的5%），并且在参比制剂中观察到这种古怪的行为，则不应对受试制剂进行处罚，并且因此，可以将该受试者从统计分析中删除。但是，这样做可能会质疑该研究的可靠性，类似于20%以上的受试者AUC外推超过20%的案例。本指导原则中推荐的统计分析是基于受试/参比的相关药代动力学参数经对数转化后总体最小均方均值之比的常规90%置信区间。有趣的是，修订后的指导原则并不要求tmax的非参数90%置信区间，但如果起效与疗效或安全性相关，则只需对中位数和变异性进行目视检查。统计模型应在方案中预先规定。传统上，在欧盟，2 × 2交叉设计中方差分析的因素为序列、周期、嵌套在序列中的受试者和制剂。当所有受试者不能在同一天给药时，考虑这段时间内的阶段并不常见。重要的是，该模型必须在所有因素都是固定的情况下进行分析。因此，不应将受试者视为是随机的。由于缺失数据的受试者被排除在外，所以这一点在2 × 2交叉设计中没有影响，像SAS®Proc Mixed那样进行归纳是不被接受的。因此，在没有缺失数据的情况下，SAS®一般线性模型（GLM）和SAS®Proc Mixed给出了相同的结果，但是，如果是重复设计，则结果会略有不同（26）。该指导原则还明确指出，观察到显著的序列效应（或周期效应）是无关紧要的，因为（不相等的）遗留效应的存在可以直接用给药前样品来进行处理。但是，这一点不适用于内源性物质。本指导原则首次承认了用两阶段设计来显示BE的可能性。在这种情况下，应注意以下几点：a.第一阶段是中期分析，第二阶段是对全部数据集的分析。第二组数据集不能单独进行分析。b.为了保持总体I型误差，需要调整显著性水平来获得高于90%的覆盖概率。因此，在中期分析中使用90%置信区间，并在全部数据集的最终分析中使用95%置信区间是不可接受的。c.必须在方案中预先规定消耗alpha的计划。每次分析中可以使用相同或不同数量的alpha。如果两个阶段的alpha相同，则Bonferroni规则（两个分析中的95%置信区间）过于保守，且可以使用94.12%置信区间。也可以用不同的方式分配alpha，作为一种极端情况，当中期阶段的目的是为了获得有关制剂差异的信息，且没有估计个体内差异和90%CI时，中期分析中计划不消耗alpha是可以接受的。d.ANOVA模型中应包含阶段性术语。然而，该指导原则没有阐明如果其具有统计意义，后果应该是什么。原则上，两个阶段的数据集不能合并。尽管指导原则没有明确规定，但即使最终样本量将根据中期分析中估计的个体内变异性来决定，方案中也必须包含最终样本量的建议，以便在中期本样量的基础上添加相当数量的受试者（如12名），以避免重复查看几乎相同的样本。即使从中期分析中获得的估计值比方案中预设的估计值低，但为了保持消费者风险，也应招募拟议的最终样本量。在修订后的指导原则中，接受范围现在已定义为小数点后两位（80.00–125.00%，窄治疗指数药物除外），就像美国FDA一样。当进行多项研究后，必须考虑完整的证据体系。仅仅因为另一项研究已经通过而忽视失败的研究是不可接受的。应对失败的原因（例如，缺乏统计能力）进行讨论。如果相关的话，可以提供所有研究的综合分析（荟萃分析），但是，结合失败的研究以显示BE是不可接受的。与美国FDA相比，NTI药物在欧盟有更严格的接受范围。修订后的指导原则规定了所有NTI药物的AUC接受范围为90.00–111.11%。但是，NTI药物的分类依赖于CHMP，而指导原则中未列出这些药物。如果Cmax的接受范围对药物的有效性或安全性监测特别重要，则必须将其收紧至90.00–111.11%，这也是CHMP的决定。例如，在空腹和餐后研究中，必须收紧环孢素常释制剂的AUC和Cmax要求，而他克莫司常释制剂只需要收紧AUC要求（26）。为了确认一种产品的已知药代动力学参数是高度变异的（CV>30%），有必要进行重复设计来估计其个体内的变异性。与美国FDA相反，欧盟指导原则只接受扩宽Cmax的接受标准，而不接受对AUC进行扩宽，并且必须证明Cmax的较大差异在临床上是不相关的。以前，需要这样的理由才能将接受范围扩大到75–133%。现在，这一决定取决于参比制剂的个体内变异性，市场上变异性大的参比制剂通常没有临床相关性，它可以从变异性为30%的80.00~125.00%，变到变异性为50%时的69.84~143.19%，这是公认最大限度。个体内变异性大于50%的情况并不常见。虽然合适的统计方法是对平均BE进行适当比例的调整，但在本指导原则中，为了简单起见对限度进行了适当比例的调整。该指导原则给出了一个表格作为示例，其中包含了不同个体内变异性对应的接受范围，但其他个体内变异性的数值可以通过以下公式获得：（U，L） = exp（±k·sWR），其中U和L是扩宽的限度，sWR是参比制剂的个体内变异性，k是规定为0.760的调节常数，与标度开始的变异度（CV = 30%）相对应。这样做是为了在标度和非标度之间有一个平滑的过渡，并避免在个体内变异性略高于30%的情况下出现过度消费者风险，这种情况非常频繁（31）。相比之下，美国食品药品监督管理局（US-FDA）采用的比例常数更为宽松（更宽的限度），且该常数相对应的CV与开始接受标度的CV之间缺乏一致性 （CV= 30%），这就增加了消费者的风险。值得注意的是，该指导原则明确指出，个体内变异性估计必须是可靠的，而不是异常值的结果，点估计必须限制在80.00–125.00之间，且任何重复设计都是可以接受的。出于质量目的以及为了确定标准，必须报告受试和参比生物批次在三种不同缓冲液（通常为1.2、4.5和6.8）以及质控介质中的体外溶出试验，但如果体外数据不同，则以体内研究为准。但是，应解决这种差异并说明理由。同样，如果体外数据不能反映体内数据，或者在体内性能可接受和不可接受的批次之间没有区分力，则应尽一切努力开发替代方法。应进行相同的溶出试验来豁免成比例的制剂。但是，如果在某些pH值下无法达到漏槽条件，则不同规格的溶出曲线可会有所不同。为了证明这种差异仅仅是由于剂量不同，申办方应在每支血管中以相同的剂量进行研究（例如，两片5毫克的片子与一片10毫克的片子），或者，通过将受试制剂的每种规格与相应的参比制剂规格进行对比，证明参比制剂存在相同的趋势。BE指南是欧盟中唯一一个解决变更具体技术要求的指南，因为美国食品药品监督管理局（US-FDA）中没有类似于放大和批准后变更指南的具体指导原则，但只有一项关于分类的法规（32）和指令（33）。该修订后的指南强调，重新配制或生产方法发生变更后都可能会影响生物利用度，除非体外数据被视为有效的替代物，否则就需要进行体内研究。只有在考虑到这种变更而定义的现有A级体外–体内相关性（IVIVC）的情况下，或在生物药剂学分类系统（BCS）生物豁免方法的情况下，才会如此。因此，对于含有低溶解度药物且尚未建立IVIVC的产品，对于可能影响生物利用度的变更则需要进行新的生物等效性研究。该指南未详细说明可能影响生物利用度的因素，必须根据现有知识来确定。对于变更所需的BE研究，如果是仿制药或混合药，且先前的制剂在未参考其他产品的申请（即完整档案、混合档案、固定剂量组合和许可证）的情况下，那么参比制剂应该还是原创药。当不需要对文献中描述的产品进行此类BE对比研究以获得授权时，要求对书目产品的变更进行BE研究似乎有些不合逻辑。在这些情况下，在那些认为溶出度研究足以确保变更后的体内性能等效的情况下，该指南提及了质量部分的其他指导原则，但可以假设新产品必须与现有产品进行比较。应采用f2相似因子对溶出曲线进行对比，任何一个制剂溶解超过85% 以上的平均值不多于一个以及其他先决条件都应考虑在内。虽然该指导原则仅涉及常释制剂，但其附录II不仅为常释剂型提供了一些指导，还为其他类型的制剂也提供了一些指导。根据该指导原则，如果经证明原料药在口腔中未被吸收，则可考虑对口腔分散片进行BCS生物豁免。然而，由于BCS生物豁免是基于用一杯水送服片剂（即溶解于250ml），而口腔分散片通常是不用水服用，因此对溶解度标准进行相应的修改似乎是合适的，并且应该在常规容器和尚未开发的类似于在口腔（例如，5ml体积）中溶解的容器中进行溶出度对比。值得注意的是，在没有水情况下证明BE被视为是最坏的情况，并且假设该制剂也将与同时服用水的制剂等效。然而，当受试片或参比口腔分散片含有甘露醇时，这种假设是有问题的，因为水的存在可能会由于甘露醇的渗透效应而增加吸收的差异。对于没有水所进行的研究，该指南规定了一种给药方法，规范给药条件并确保唾液充足（给药前直接用20ml水湿润口腔，给药后1小时内不要喝水）。同样的规则适用于类似的剂型：口腔分散薄膜、口腔片、舌下片和咀嚼片。该指南强调了口服溶液中辅料的重要性，因为在过去，由于配方中添加了共溶剂，溶液中的低溶解度药物不需要显示BE。然而，不同的共溶剂可能具有不同的增溶能力，且不同制剂间的沉淀可能不同，这反过来可能会影响生物利用度。同样，影响胃肠道转运、吸收或体内稳定性的辅料必须更仔细地进行评估，因为少量的山梨醇可能会影响利培酮等某些药物（34），或者少量的表面活性剂能够增加阿伦膦酸盐等低渗透性药物的生物利用度，其生物利用度可以增加至5到6倍（35）。对于静脉注射水溶液，如果与药物相互作用的辅料在组成上存在差异（例如，复合物形成），则不可能豁免BE研究。对于与混合申请中参比制剂浓度相比浓度不同的静脉注射水溶液，只要没有与更高浓度相关的安全性/耐受性问题，则可以授予豁免，因为药物在血浆中会被稀释。对于其他肠胃外途径，当使用不同但相似的辅料时，修订后的指南强调了粘度相似性的重要性。如果受试产品中使用相同的定性和（类似）定量成分，则可以确保这一点。该指南还澄清，静脉注射肠外营养的脂类不需要证明BE。如果组成在质量和数量上相同，并且理化特性（如粒径分布、Zeta电位和流变学）相似，则可以豁免静脉乳剂对比BE的要求，但是指南中没有说明这些属性必须是多么相似，而且常规的质量特征描述并不包括适当的可比性研究。同样地，如果胶束在血浆中稀释后分解，并且组成在质量和数量上是相同的，则静脉注射胶束形成制剂的BE要求也可以豁免。此外，只要表面活性剂没有改变，这种豁免也适用于定性或定量成分发生微小变化的情况。但是，其他辅料（共溶剂）或其用量的差异是否不会影响生物利用度或安全性/耐受性状况尚不明显。例如，共溶剂的变更可能会导致稳定性不同、储存中沉淀更频繁，这并不妨碍销售，但由于这些产品不能更换，所以可能会促进滥用。同样，该指南建议进行一些体外试验（例如临界胶束浓度、增溶能力、游离和结合药物以及胶束大小）来确保相似性，但并未阐明完整的试验列表及其相应的可接受范围。该指南明确指出，只有当局部作用和局部应用的产品配制成具有相同定性和定量成分的溶液，或辅料存在微小差异时，临床研究才可能豁免，前提是这些微小差异不会改变药物的局部利用度，从而达到治疗等效性。重要的是，该指南强调了生物利用度对比研究的必要性，当存在全身不良反应的风险时，出于安全方面的考虑，其优势限度仅为125.00%。这突出表明，当质量方法要求BE在80.00–125.00%之间时，临床观点在局部作用、局部应用产品中占主导地位，因为更安全的产品可能是不同的，但不能成为可互换的产品。在欧盟，即使临床终点比PK的灵敏性低，但疗效的临床证明将优先于药代动力学差异，因为批准产品是为了上市，而不是为了互换。如前所述，可互换性是一项可能会因医药产品的评估和批准方式而受到影响的国家政策。欧盟指导原则在BCS生物豁免领域的主要进展是不仅接受了前一版本中提到的I类药物的生物豁免，而且在严格条件下还接受了III类药物的生物豁免。但该方法与美国食品药品监督管理局的方法相比存在一些差异，如US-FDA中，治疗指数窄的药物排除在外，且生物豁免政策仅适用于相同的常释口服固体剂型的产品（尽管2001/83号指令中对仿制药的定义允许这样做，但胶囊与片剂是不可接受的）。同样地，尽管在欧盟对仿制药的定义中，活性物质的不同酯类、醚类、异构体、异构体的混合物、络合物或衍生物被认为是相同的活性物质，但只有I类药物的不同盐可接受生物豁免。尽管该指导原则规定其仅适用于具有全身作用的产品，但同样的科学原理也可适用于胃肠道局部作用的产品（如阿卡波糖）。相比之下，因为尚未开发出令人满意的溶出方法，随意它不适用于不在肠道吸收的全身作用产品（例如舌下和口腔）和口腔分散片，如上所述，口腔分散片通常不用水服用，因此，基于250 ml的溶解度定义并不适用。在本指导原则中，高溶解性药物的分类是基于最大单次剂量，而不是简单的最大规格，相关的pH范围是从1到6.8不等，而不是7.5（36），并且pH表征要求不包括pKa ± 1，而只包括pKa。在本文件中，渗透性的概念已改为可吸收性，高可吸收性的标准完全是基于“人体”吸收（37，38），通过质量平衡研究或绝对生物利用度研究确定，大于或等于给药剂量的85%。来自动物或培养细胞的数据只被认为是支持性的。质量平衡研究的数据必须根据生物药剂学处置分类系统来解释（39），同时考虑到氧化代谢产物和共轭性代谢产物只有在吸收后才会在体内形成。虽然该指导原则指出，口服固体剂型和口服溶液之间的BE是具有支持性的，因为它表明由于剂型造成的吸收限制可以忽略不计，但这并不表示吸收是完全的。在这种情况下，溶出度相似性对于III类药物来说就不那么重要了，因为固体剂型和溶液之间的BE对低渗透性药物来说通常比高渗透性的药物来说更易实现。根据指导原则，应该在pH值为1.2、4.5、6.8以及最小溶解度的pH中采用一批以上的受试和参比产品进行溶出曲线对比。这些研究的搅拌转速已经确定为浆法-50转/分钟以及篮法-100转/分钟。没有关于何时可以接受不同转速的指导原则。因为不同的搅拌转速有助于证明相似性，如世界卫生组织推荐的浆法-75转/分钟，所以有待商榷。I类药物的溶出曲线必须相似且快速（30分钟内大于85%），而III类药物的溶出曲线相似且非常快速（15分钟内大于85%）（36）。尽管对于某些含有III类药物的产品（或许是对那些有吸收窗的产品）而言，快速溶出并不那么关键，但要求非常快速的释放是为了确保溶液从胃中排空，因此可以认为它与口服溶液类似。在欧盟指导原则中，因为可能会影响生物利用度的辅料在受试和参比制剂中的用量必须一致，所以应重点关注辅料。相比之下，美国食品药品监督管理局声称，大量的表面活性剂或者甘露醇以及山梨醇必定会改变生物利用度（1）。然而，欧盟的经验表明，少量的表面活性剂（例如：SLS）或山梨醇就会影响药物的生物利用度（例如：4mg的SLS会使阿仑膦酸盐的生物利用度增加5-6倍，7mg的山梨醇会降低利培酮的Cmax，60mg也会降低AUC）对于I类药物，不会影响生物利用度的辅料可以不同，但对于III类药物，即使是这些辅料也必须相同且用量非常相似。结合生物等效性领域的重要进展，包括对III类药物基于BCS的生物豁免的要求以及对高变异性药物Cmax的接受限度的调整方向，欧盟《生物等效性研究指导原则》代表了目前ICH地区最具进步性的生物等效性指导原则。该指导原则中描述的BE研究原则与早期欧盟指导原则以及当前FDA文件中提出的原则一致。但是，欧盟指导原则中有了一些新的细化改良，如上文所述。本文介绍了这些新颖之处的价值，并将本指南中提到的欧盟方法修订版与之前的欧盟指南和当前的FDA指南进行了比较，鼓励人们更好地理解欧盟对BE检查的现行要求。
