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液相色谱柱与方法开发指南

安捷伦、沃特世液相分析方法开发指南合集版本

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液相色谱柱与方法开发指南

【安捷伦】液相色方法开发指南

液相色谱柱与方法开发指南

【沃特世】液相分析方法开发工具书

 

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方法开发:从何处入手
方法开发的总体目标是在尽可能短的时间内优化目标物的分离度。当您开始考虑进行方法开发时,最好先
回顾一下分离度的关键影响因素。可以复习色谱基本概念一章(第 5-11 页)。
典型的方法开发流程包含以下步骤,同时也是本章内容的主线:
1. 选择分离模式
2. 选择色谱柱和填料规格
3. 选择固定相填料
4. 选择流动相溶剂
5. 如果分离模式需要,调节流动相的 pH
6. 进行等度或梯度初步实验,以确定边界条件
7. 优化实验条件

模式选择
您应该做的第一件事就是选择 HPLC 模式。通常分离模式是由以下因素决定的:目标物的类型和溶解度、目标物分子量 (MW)、样品基质以及可使用的固定相和色谱柱。图 40 和 41 根据化合物分子量和将使用的溶剂,列出了评价分离模式最佳选择的步骤。

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有时,一组特定分析物可以用一种以上的模式分离。例如,离子型化合物可以用树脂或硅胶基色谱柱进行
离子交换色谱分离,也可以用反相柱进行反相离子对分配色谱分离。许多色谱工作者都是以反相 HPLC 开始分离,因为反相色谱已发表了许多应用文章可供参考。用反相色谱可以分析非极性、非离子型、离子型和极性化合物,选择适当的流动相和分析条件,有时整个分析都可以仅用这一种模式完成。继反相色谱之后,我们还将在本章的最后讨论其它分离模式。

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选择色谱柱和填料规格
图 42 显示了评价色谱柱固定相和色谱柱规格时考虑的部分参数。要进行高通量分析,小粒径短柱(如亚
2 μm)是最佳选择。如果您要对包含多种组分的样品进行复杂的分离,可以选择填充小粒径填料的长柱,
切记,这种色谱柱的操作压力可能会显著增加。如果您要进行质谱分析,窄内径柱(如 2.1 mm 内径)是最佳选择,因为与质谱检测器联用需要较低流速。制备色谱常使用填充较大粒径填料(5 或 10 μm)的大内径柱。对于这种色谱柱,高流速正好与制备柱的流量需求相匹配。
填料的孔径非常重要,因为待测分子必须与多孔结构“相匹配”,才能与固定相发生相互作用。较小孔径的填料(孔径 80 到 120Å)最适合分离分子量 2000 以下的小分子。对于分子量超过 2000 的较大分子,需要使用较大孔填料;例如,分离蛋白质的常用孔径是 300Å。对大多数分离来说,都可以使用不锈钢柱硬件。但是,如果您要分析的是可能与金属表面发生相互所用的敏感分子,如某些类型的生物分子,则需要使用 PEEK 或玻璃内衬不锈钢等柱材料。对于痕量阳离子的分离,PEEK 柱的惰性最高。请注意,PEEK 柱的压力上限为 400 bar。

选择固定相
有包含各种分离模式的多种固定相可供选择。许多色谱工作者都以最通用的十八烷基硅烷化 (C18) 固定相开始进行反相色谱分离,尤其是对小分子的分离。下面我们将着重讨论反相分离的问题,本章后面部分再涉及其它分离模式。
反相色谱的方法开发
反相色谱是到目前为止最通用的 HPLC 方法 — 大约占所有方法的 60%,将近 95% 的色谱工作者都在使用。在反相色谱中,分析物在极性流动相和非极性固定相之间分配 — 与正相色谱相反。通常,分析物与疏水固定相之间发生非极性、非特异性相互作用,即,样品分配入固定相。我们使用 C18、C8、苯基或 C3 等固定相,产生极性差异和/或基于分子芳香结构的差异。
极性较强的分析物比非极性分析物在反相固定相中的保留弱。保留与分析物的疏水性基本上成正比。具有
大疏水基团和带较长烷烃链的同系物,比结构中带极性基团的分子(如氨基、羟基)保留更强。如果有一
系列脂肪酸,如 C12、C14、C16 和 C18,则 C12 保留最弱,C18 保留最强。
流动相主要由两部分组成:
1. 水,可含缓冲液,或用酸或碱调节 pH
2. 可与水混溶的有机溶剂
反相色谱有多种用途,有时在同一色谱分析中就可以分离非极性、极性、可离子化的和离子型分子。一般
来说,对于可离子化的化合物,为了增加保留和改善峰形,我们会在流动相中加入改性剂,以抑制离子化,减弱其极性,使其保留更强。

反相色谱固定相的选择
下面我们要讨论如何开发反相方法。图 43 显示了如何根据特定分析物的分子量选择合适固定相的一般流程。首先,必须选择孔径,以确保目标分子能够进入填料,在孔隙中与疏水固定相发生相互作用。然后,选择固定相,多数情况下是从 C18 固定相开始。根据方法的最终目标不同,可以选择常规分析柱,如果需要进行高通量分析,可以选择“快速分析”反相色谱柱。

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反相色谱: 固定相选择概览

大多数色谱工作者是从 C18 固定相开始,但如图 44 所示,如果 C18 不能进行有效分离,其它固定相也可以提供不同的选择性。在本例中,我们在含不同亚 2 μm 填料的快速分离高通量短柱上分离了心血管药物,使用含 70% 磷酸盐缓冲液 (pH 3.0) 和 30% 乙腈的等度缓冲流动相。

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1. pH的影响
当分析物含有可电离官能团时(可电离官能团指,在不同的pH条件下可处于不同程度的电离状态,例如:伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基),pH条件将强烈影响分析物的反相保留效果,pH条件的改变也会造成最强烈的选择性改变效果。

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pH是如何影响反相保留性质的? — 对于可电离化合物,要获得最强的反相保留,分析物应尽可能的不带电或电离,此时分析物的极性相对较小,在反相色谱柱上的保留就更强。因此,酸性化合物应使用低pH条件,而碱性化合物更适用高pH条件。中性化合物没有任何可电离官能团,因此,不会受到pH条件影响。这些点线图,就好比滴定曲线,与分析物分子pKa值高度相关。在开发方法时,应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件,否则,pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。保留曲线的“平台区”是分析方法耐用性较强的区域。

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pH的选择与色谱柱的选择 — 对于帕罗西汀和它的有关物质B、D、G、F,因其胺基结构在不同pH条件下电离状态不同,使用pH 10条件比pH 3条件能够获得更强的保留和更好的分离选择性。由于具有更高分辨率和更好的选择性,pH 10是适合被测物的pH值。下一步是评估在相同pH 10值下三种不同色谱柱的色谱图,以选择具有最佳分辨率的色谱柱。与其它纯硅胶色谱柱相同,HSS T3色谱柱只能用于pH值2-8环境下,因此不在评估之列,三种色谱柱都显示了可检测所有组分的能力,由于C18的通用性,因此选择BEH C18色谱柱来对比不同有机改性剂的选择性。

2. 色谱柱的影响
在选择色谱柱进行分析方法开发时,应充分认识,色谱填料基质(硅胶颗粒、杂化颗粒、聚合物颗粒)因其化学性质不同而会提供不同的保留与选择效果。色谱填料表面残留的硅醇基,会与分析物发生反相保留以外的次级作用。色谱填料的纯度、填料表面硅醇基残留数量,以及填料的封端技术,都会影响次级作用的程度大小以及相应的色谱分离分析效果。

不同的键合相,不同的选择性

  • 疏水性-长的烷基链,提供更强的保留
  • 硅羟基活性-影响色谱峰的对称性和次级相互作用
  •  抗水解稳定性-键合相(如C18)通过更多的键键合到基质颗粒上(如:三键键合
    方式),更长的柱寿命
  • 官能团的密度-影响载样量

在传统的HPLC系统上,随着可变的pH值和有机溶剂的组合,筛选一系列的色谱柱,会花费大量的时间。使用ACQUITY UPLC®色谱柱管理器、高分辨的亚2 μm短柱,配合ACQUITY UPLC系统,将大大缩短这个过程,从以往的数天时间减少到数小时。

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色谱柱摸索试验:使用安装了ACQUITY UPLC色谱柱管理器和ACQUITY UPLC色谱柱的ACQUITY UPLC设备测试摸索条件如图所示,图示这些条件的最终目标是得到一系列不同的色谱图,其能提供选择合适色谱柱所需信息。BEH C18色谱柱是非常好的通用C18,适于宽pH值范围使用,BEH Shield RP18为烷烃链C18提供选择性补充,BEH Phenyl色谱柱为这两种C18色谱柱提供选择性补充,为了满足极性洗脱保留时间的试验设计需求,也可选用HSS T3色谱柱。沃特世提供完全一致的UPLC®柱和HPLC柱便于方法转换。

3. 有机溶剂的影响
甲醇和乙腈,是用于反相分离的典型有机溶剂。除了洗脱强度、粘度(与柱背压有
关)、紫外吸收性不同,甲醇与乙腈在化学选择性上也有所不同,甲醇可以发生氢键
作用,因此会提供显著不同的选择性。
甲醇
■ 洗脱能力较弱
■ 质子化溶剂,提供氢键作用
 乙腈
■ 非质子化溶剂
■ 洗脱能力较强
■ 粘度较低(柱背压更低)

有机溶剂相对洗脱强度曲线:

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溶剂的选择 — 谱图显示,与乙腈相比,甲醇的洗脱能力较弱,因此所有分析物都获得了更强的保留。但是,对于这个应用,乙腈提供了更好的分离选择性。因此,pH10、色谱柱BEH C18和乙腈的条件组合,就可以用作下一步的优化微调。

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